摘要
流式细胞分析的临床应用日益广泛。由于流式细胞分析强大的用户自定义功能、不同原理的仪器配置差异，加之缺乏标准品等诸多因素，导致结果可比性有待提高。因此，流式细胞分析面临规范化和标准化这一巨大挑战。规范操作过程包括标本染色和离心的规范化、合理选择抗体和组合、标准化仪器检测以及数据分析等将极大促进流式细胞分析的规范化和标准化工作进展。
流式细胞分析的临床应用日趋广泛，主要应用有淋巴细胞亚群、造血干细胞计数、白血病免疫表型、阵发性睡眠性血红蛋白尿症诊断、血小板自身抗体及膜糖蛋白检测等，为机体免疫功能评估、血液与淋巴组织肿瘤的诊断、分型、鉴别诊断和预后等提供依据。随着相关技术的进步和发展，临床使用的流式细胞仪从最初的单激光3色，已经发展为3激光10~12色，甚至5激光18色，一些新型流式细胞仪如光谱流式细胞仪更是可以提供至少24色。毫无疑问，更多参数流式细胞仪的应用给使用者提供了更多的数据信息，有助于提高疾病的诊疗效率。
流式细胞分析具有强大的用户自定义功能，即不同用户（实验室）可根据自己实验目的建立检测流程，从某种程度上讲，流式细胞分析属于实验室自建方法（laboratory designed test，LDT）范畴。因此，各个实验室操作步骤如染色过程、抗体组合、数据分析等方面都不尽相同。另一方面，不同类型的流式细胞仪在激光光源、荧光素种类、抗体克隆、分析软件等的设置也不尽相同。此外，目前尚未研发出相关项目的标准品。以上诸多因素导致了流式细胞分析的结果存在较大差异，结果可比性有待提高。行业内也面临规范化、标准化多参数流式细胞分析这一巨大挑战。
一、规范操作过程
流式细胞分析的首要操作是标本处理，这个环节直接影响检测结果一致性和可比性，是标准化至关重要的一环。具体步骤有标本采集、接收、标本处理。前2个因素的规范化要求在临床实验室标准化协会等多个文件中均已说明［1,2］。标本处理通常分为染色和离心2个步骤，规范地进行标本染色和离心可以确保结果一致性。
（一）标本染色规范化
临床实际工作中，标本染色程序根据实验目的进行选择和确认。选择原则：前向散射光（forward scatter，FSC）和侧向散射光（side scatter，SSC）的变异系数（coefficient of variation，CV）低；标本中主要细胞亚群的FSC和SSC平均通道数要有明显差别；细胞损失最小；荧光强度保持最高；不影响耦联荧光染料的稳定性；背景染色低；室内误差最小；操作简便快速。
（1）细胞表面抗原染色
细胞表面抗原染色是指对细胞膜抗原进行荧光素标记抗体染色的过程，也称为膜染色。对于外周血和骨髓样本，临床实验室标准化协会推荐采用红细胞裂解法进行有核细胞膜染色。红细胞裂解的方法有多种，其中采用溶血剂进行裂解是推荐方法。为了得到最好的染色效果，实验室应评价不同溶血剂的效果。具体方法是采用不同溶血剂进行外周血细胞亚群的测定，观察FSC、SSC、各个抗体阳性荧光强度和CV来评估溶血剂对细胞的影响，是否符合上述原则的。有文献比较了常见的几种红细胞裂解液的效果［3］，读者可以参考。
（2）细胞内抗原染色
细胞内抗原染色需先进行细胞膜的渗透、固定，即先采用破膜剂进行处理，然后进行染色。不同的破膜剂影响并不一致，因此，进行细胞内染色时还应该评估破膜剂效果。类似于评估溶血剂的流程，采用不同破膜剂进行外周血细胞亚群的测定，观察FSC、SSC、各个抗体阳性荧光强度和CV来评估破膜剂对细胞的影响。
（3）标本荧光染色过程
标本荧光染色过程可以有不同的流程顺序：染色-裂解-洗涤，染色-裂解-免洗，裂解-染色-洗涤。不同的染色流程对荧光强度有明显影响，根据多中心数据表明，染色后裂解继而洗涤，可以改善FSC、SSC的CV，得到最高的荧光强度［4］。
（二）离心规范化
标本处理环节需要通过离心进行洗涤，离心不可避免的会导致细胞丢失。有研究显示，样品制备过程中丢失的细胞数最多可达一半［3］，尤其是进行细胞膜和胞内免疫球蛋白染色时，需要先进行样本洗涤，再染色，如因离心丢失细胞数量太多，会导致细胞种类比例失真，出现假阴性结果。因此，样本染色流程中一定要评估离心速度、时间，保证离心前后细胞数量的一致性。
目前流式细胞分析的标本处理仍以手工处理为主。除了上述环节外，还涉及加样这一步骤，故加样枪的准确性应定期评估。随着技术发展，目前已经有自动化样本处理仪如BD medimachine、FlowUltron-R100应用于临床，这类仪器的使用会大大提高检测效率和分析精密度。当然，其性能也需要进行评价。
二、抗体标准化
（一）抗体选择
抗体选择的一般原则是强荧光染料标记抗体去识别、结合低密度抗原，弱荧光染料标记抗体去识别、结合高密度抗原，这样能够去除背景荧光。对于同一抗原，如何选择不同克隆号和荧光素标记的抗体，应根据量化的抗体性能评价程序来选择。主要考虑的因素有抗原/抗体比例、最佳信噪比、减少荧光背景、抗体特异性，以及多个抗原表位的空间位阻效应等。
抗体选择可通过评估不同抗原表达的平均荧光强度或者染色指数（stain index，SI）来进行。SI定义是阳性细胞群平均荧光强度（median fluorescent intensity，MFI）和阴性细胞群MFI的差，除以阴性细胞群宽度，即2倍阴性荧光强度标准差数值。SI既与特定通道的光信号检测能力有关，也与相应荧光染料的光量子产出能力有关。同时，该荧光通道的背景信号也会影响SI。因此，通过SI可以了解该通道荧光检测能力，识别弱阳性的能力。SI越高，该荧光通道识别弱阳性的能力越强。反之，SI越低，该荧光通道识别弱阳性的能力越低。
（二）抗体组合
大部分流式细胞分析都要用到多种抗体的组合，不同的抗体组合也是影响标准化和结果可比性的重要因素之一。为此，多个学术团体发布针对不同疾病的推荐抗体组合，如国际血液学标准化委员会的《白血病和淋巴瘤免疫表型的国际共识》［7］，以提高结果的重复性和可比性。2012年人类免疫计划协会提出采用统一抗体组合分析人体免疫细胞的计划［8］，并在Cytometry杂志上以新的出版格式发表，这种格式被称为优化的多色免疫荧光抗体组合［9］。这种格式提供了特定细胞亚群的最佳抗体组合方案、检测方法以及数据分析过程，既为该领域人员提供了交流平台，又为其他研究者提供了优化好的实验方案。截至2020年，已有78个优化的多色免疫荧光抗体组合发表，用以描述特定细胞亚群的检测方案，供专业人员参考，比如采用28色抗体组合方案检测树突细胞的方案等［10］。
此外，试剂的稳定性会影响染色模式和染色强度。可通过使用稳定的试剂混合物来解决这一问题。这种混合物不仅易于使用，而且减少了移液误差造成的偏差［11］。已有厂商可以提供即用混合物或干粉状混合试剂。
三、仪器检测的一致性
不同生产厂家流式细胞仪的检测结果的可比性，一直以来是标准化的重要一环。不同厂家的仪器，其激光设置、液流系统、检测系统等环节都具有各自特点，这对于标准化是非常大的挑战。尤其是对于定量项目比如淋巴细胞亚群、CD34 细胞计数等。流式细胞术分析的定量项目尚无标准品，因此，标准化的过程在很大程度上依靠校准微球。
为了实现仪器检测的标准化和一致性，许多学者、团体为此进行了各种尝试和探索，如EuroFlow、美国儿童肿瘤协作组、人类免疫计划协会等。为了研究2 500多例自身免疫疾病患者的白细胞表型及新亚型，使其结果具有可比性，欧洲学者进行了PRECISESADS 研究［12,13］，该研究比较了来自不同中心的11台不同仪器，包括贝克曼库尔特的Navios、Gallios、碧迪的CantoⅡ、Fortessa、Verse、Aria，并将其标准化。主要方法是选择一台流式细胞仪作为参考仪器，使用VersaComp抗体捕获微球固定8种不同的荧光素标记抗体的MFI。其他中心调整光电倍增管电压以达到相同的MFI。随后，所有中心每天获取8色微球数据，以跟踪仪器的稳定性。同时，一份外周血分发给所有中心，检测这个样本的外周血细胞亚群比例及MFI。结果显示，11台仪器各类白细胞比例的CV为1.8%~23.9%，细胞表面标记物MFI的CV为12.4%~22.3%。这表明多中心分析的结果具有较好一致性。瑞士流式细胞分析协会也采用同样的流程进行研究。采用Euro Flow规范化的流程，最初11个标记抗体中有7个标记抗体MFI的CV低于30%。随着研究的进行和调整，最终89%参与者中有90%标记抗体检测的MFI达到了控制要求，这与EuroFlow进行的质量评估结果一致［14］。以上研究均说明8色流式细胞仪在实验室间跨平台标准化是可行的，在不同仪器间如碧迪FACSCanto Ⅱ和贝克曼库尔特Navios，在规范好流程的基础上结果具有可比性。
四、数据分析的一致性
流式细胞术检测的数据分析不同于其他检测结果直观、易懂，需要用户结合医学知识以及患者具体情况进行分析报告。随着更多色荧光素的使用，得到的数据越来越多，需要对获得的多个细胞亚群信息进行全面分析。
目前流式细胞术的数据分析仍以人工分析为主，ISAC发表了“流式细胞术实验的最低信息”［16］，其中对设门策略进行了完整解释，包括数据分析，因此可以借鉴已发表的文献进行数据分析，以达到标准化和规范化。随着人工智能的发展，许多研究者尝试采用软件工具进行自动化分析，这可以使设门程序更加客观，从而提高设门和计数的可重复性［17,18］。EuroFlow收集了6 000多个以标准化方式获取的匿名FCS文件，针对8色抗体组合方案及标准化操作程序，研发了infinicyt分析软件，该软件极大地降低了数据分析的难度［19］。加拿大的国家移植研究项目发起的ONEstudy研究，研发了一种自动分析软件，该软件可以自动分析不同中心的数据，与人工分析有很好的相关性，但对于少量的亚群如浆母细胞、单核细胞亚群，相关性较差［18］。前述的PRECISEDS研究，为了使来自11个不同中心数据能高效、一致地分析，研究者开发了自动分析软件，该软件是基于监督机器学习的方法，利用数据预处理、特征工程、转移学习和数据增强等方式研发出来。采用Kaluza??软件对11个中心的300例患者结果进行了自动分析与传统的“手动”分析的比较。结果显示，各类细胞比例、绝对值和MFI的数据具有很好的相关性［12,13］。
五、流式细胞术分析的发展趋势
目前临床使用的流式细胞仪可以检测至少8种荧光素，因此不同仪器间标准化是必须的，也是可行的。在未来，标准化的抗体组合可能采用现成的试剂混合物，简化样品制备并减少差错。自动数据分析软件的开发，会使工作人员更容易地使用这些工具，从而达到校准化，实现流式细胞分析结果的可比性。
参考文献（略）
