众所周知，目前市场上主要以二代测序为主，二代测序过程中第一步是文库构建，本期为大家介绍一下常见文库构建的种类。
针对于illumina测序平台，DNA类的文库主要分为：DNA小片段文库、DNA大片段文库、Exon文库、PCR-Free文库和单细胞文库等。
DNA小片段建库
DNA小片段文库是指片段大小在1kb以下的普通DNA文库（200bp、350bp、500bp等），DNA小片段文库可用来进行人重测序，动植物、微生物的de novo和重测序，16s rRNA测序，宏基因组测序等项目类型的文库构建。DNA小片段文库的构建主要包含以下2种方法：
01传统文库构建流程
传统建库流程主要分为以下几个步骤：
（1）将待测序的DNA分子用超声波打碎成200-500bp长的序列片段
（2）将打碎后的基因组进行末端补平
（3）在补平后的片段3’端加A和5’端进行磷酸化
（4）对修复后的片段进行接头连接
（5）对接头连接后DNA片段进行PCR扩增
（6）对扩增后的文库进行磁珠纯化
DNA小片段文库建库原理图如下：
02转座法建库流程
转座法建库相对于传统建库，其实验方法简单快速，5分钟内即可同时完成DNA片段化和接头连接，而且所需要的DNA量少。目前市面上能提供具有自主知识产权专利的Tn5转座法建库试剂盒的公司就只有Illumina公司和TransGen公司。由于转座酶与所输入的基因组量有一定的比例关系，因此我司开发了2款转座酶法建库试剂盒：
（1）针对50ng起始量DNA
（2）针对1ng起始量DNA
转座法建库原理图如下：
DNA大片段建库
DNA大片段文库，又称之为末端配对（mate-paired）文库，片段长度大于1kb，主要用于动植物，微生物的de novo测序。
DNA大片段文库的构建主要分为以下几个步骤：
（1）将待测序的基因组打断
（2）将打碎的基因组进行末端修复和进行Biotin标记
（3）将标记好的基因组环化
（4）将环化后的基因组打碎
（5）磁珠捕获片段化的基因组
（6）对捕获后的基因组进行末端修复加A和加接头
（7）对接头连接后的基因组进行PCR扩增
（8）将PCR扩增后的文库进行分选回收
DNA大片段文库建库流程图如下：
Exon文库
人类外显子组总共约30Mb，占人类基因组约1%，外显子具有高度的保守型，且大部分疾病的致病位点位于外显子区。外显子测序是指利用序列捕获技术将外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。Exon文库主要用于人全外显子测序和目标区域测序。
外显子文库的构建流程主要分为以下几个步骤：
（1）将质量合格的基因组DNA超声打碎成200-300bp左右的片段
（2）将打碎的基因组DNA片段进行末端修复，3’端加A和5’端进行磷酸化
（3）对修复后的片段进行接头连接
（4）对接头连接后DNA片段进行线性扩增（LM-PCR）制备成杂交文库
（5）将构建好的文库进行探针杂交捕获
（6）将捕获后的文库进行PCR扩增富集
人全外显子测序与全基因组测序相比较，外显子测序具有测序覆盖度深，数据准确性高等优势，对于研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势，因此主要应用在肿瘤基因测序方面。
PCR-Free文库
PCR-Free文库，顾名思义，就是在文库构建过程中不需要进行PCR的文库。主要是针对一些特殊样本，比如GC含量高、PCR扩增困难的样本和PCR产物。不足之处在于所需的样本起始量较少。
PCR-Free文库的构建与传统小片段文库构建流程相比较，前面步骤相同，只是不需要进行PCR扩增富集。文库构建原理流程图如下：
单细胞DNA文库
随着二代测序技术的发展，把一次实验测许多条DNA序列的这个难题解决之后，一次把一个人的全基因组给测出来，最极限的情况，就是样本量少到一个细胞，就可以测出整个基因组的序列信息。同时也需要克服以下三个难题：
（1）如何实现均匀扩增
（2）全基因组覆盖问题
（3）如何实现较高的扩增效率
为了解决上述的难题，科学家想了很多办法，到目前为止，大家比较认可的方法有2种：第一种是MALBAC方法，第二种是MDA方法。
1MALBAC方法
MALBAC方法，它的全称是：MultipleAnnealing and Looping-Based Amplification Cycles，是谢晓亮教授发明的方法，如下图所示：
上图中黑色的线条，就是基因组模板DNA，这些红颜色的线条就是扩增引物，扩增引物的5’端有27个碱基的通用序列，这些通用序列会作为未来的PCR通用扩增引物的结合序列。扩增引物的3’端有8个随机序列的碱基，这8个碱基可以随机地杂交到基因组DNA的互补序列上。这些灰色的椭园是Phi 29 DNA聚合酶，Phi 29 DNA聚合酶有一个特点，它不仅可以生成新的DNA链，它还能把之前已经合成好的DNA链给解链开。再形成自己的新链，这个特点能够把每个循环所能合成的DNA新链的数量提高几倍、甚至几十倍、上百倍。接下来，就是做5个MALBAC循环，第一个循环得到的是 5’端有通用序列的DNA片段；第二个循环后，产生的扩增产物大部分是5’端有通用序列，3’端有与通用序列互补的序列片段。该方法在每个循环的最后，加了一步58度退火，这一退火过程让完整扩增的产物，它的两端发生链内杂交，这样3’端的序列就不能与新的、游离的引物发生杂交，也就不会引新的、发起始于3’端的扩增，就避免了完整扩整的产物的自我指数扩增。
MALBAC方法设计的扩增引物有8个随机序列，这样就可以在模板上随机地找结合位置，因此所有的位点都有一样的机会被扩增。该方法扩增的产物分为3种：第一种，就是m* n 个“完整扩增产物”，即最主要的产物，这里“m”就是循环的次数，“n”是一个循环中，有多少个扩增，引物可以粘到一个模板上。第2种扩增产物，就是(m 1)* n个“半扩增产物”，第3种DNA，就是原始的DNA模板，这里完整产物的数量是“m*n ”，也就是说，扩增产物（的数量）与扩增的循环次数“m”成正比，而不是与m的平方成正比，更不是与2 的M次方成正比，这就达到了我们想要的“线性扩增”的目的，即扩增产物（的数量）与扩增的次数成线性关系，进而实现了单细胞测序当中第一个要求“线性扩增”。第二个要解决的难题，就是“全基因组覆盖”问题，这里是利用Phi 29聚合酶一次在模板上能聚合出多个新链来达到这个目的。在5轮的扩增之后，每个模板都会有5*n^2个扩增片段，这样就可以保证建库时大多数的基因组区域可以被建成文库。 第三个要解决的问题“高效率扩增”，仍是利用了Phi 29酶一次能得到多个扩增片段来实现的。
2MDA方法
目前市场上还有一种单细胞扩增技术，叫MDA扩增技术，它的全称是Multiple Displacement Amplification。该方法的技术核心是利用Phi 29 DNA聚合酶来进行直接的扩增。Phi 29酶的特点是，它可以把双链DNA进行解链，然后在常温条件下，就可以将原始模板进行大量扩增。原理如下图所示：
上述两种方法各有优劣。MDA方法的优势在于实验方法简单，且扩增效率更高。MALBAC方法的特点在于它的扩增均一性更好，但是扩增效率相对比较低。
目前单细胞测序技术的应用主要有以下几个方面：
（1）体外受精胚胎测序
（2）CTC测序，找到突变位点，针对性地进行靶向药物治疗
（3）肿瘤亚细胞群测序，监测肿瘤细胞不断发生的新的突变，并找到对应的治疗方案
（4）免疫细胞测序，免疫细胞在对抗原发生识别后，其基因组发生重排并产生对抗原特异的抗体，测序可找出特异的基因结构
以上为本期为您介绍的内容，希望对您的科研有所帮助，下期见！
研发部 白 霞 ▏文案
